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體視顯微鏡樣品制備五步法:從固定到成像的全流程解析

作者:admin 瀏覽量:25 來源:本站 時間:2025-04-07 11:23:15

信息摘要:

作為宏觀觀察利器,體視顯微鏡以立體成像、大景深、寬視野著稱,廣泛應(yīng)用于質(zhì)檢、生物解剖、工業(yè)檢測等領(lǐng)域。其樣品制備雖不如電子顯微鏡復(fù)雜,但仍有五大關(guān)鍵步驟直接影響成像效果。本文基于Leica、Olympus等設(shè)備使用規(guī)范,系統(tǒng)梳理從樣品固定到三維合成的全流程。

作為宏觀觀察利器,體視顯微鏡以立體成像、大景深、寬視野著稱,廣泛應(yīng)用于質(zhì)檢、生物解剖、工業(yè)檢測等領(lǐng)域。其樣品制備雖不如電子顯微鏡復(fù)雜,但仍有五大關(guān)鍵步驟直接影響成像效果。本文基于Leica、Olympus等設(shè)備使用規(guī)范,系統(tǒng)梳理從樣品固定到三維合成的全流程。

一、樣品固定:穩(wěn)定性與可視化的平衡術(shù)

固定方式選擇

微型樣品:導(dǎo)電膠粘貼法(銀膠/碳膠)

脆弱樣品:瓊脂糖包埋法(1%濃度凝膠)

三維樣品:昆蟲針定位+蠟封固定

避免使用油性膠水(易反光)

固定角度優(yōu)化

昆蟲標(biāo)本:腹面朝上+45°傾斜

電子元件:引腳朝上+標(biāo)簽標(biāo)注

植物組織:切面朝上+甘油保濕

體視顯微鏡.jpg

二、擺放定位:空間層次感的營造

景深控制技巧

多層樣品:階梯式擺放(每層間隔>5mm)

高矮樣品:泡沫塊墊高法

景深計(jì)算公式:DOF=2λ/(NA)2(λ=波長,NA=數(shù)值孔徑)

背景處理

反光樣品:消光漆噴涂(啞光黑)

透明樣品:襯背染色(亞甲基藍(lán)溶液)

吸光樣品:環(huán)形LED補(bǔ)光

三、照明優(yōu)化:光影魔術(shù)的**調(diào)控

光源選擇矩陣

觀察對象

光源類型

色溫要求

亮度范圍

金屬部件

環(huán)形LED

4000K

500-2000lux

生物組織

光纖冷光源

6500K

300-1500lux

彩色樣品

三基色熒光燈

93 CRI

800-3000lux

光路調(diào)節(jié)

暗場觀察:關(guān)閉透射光+側(cè)光45°入射

偏振光:添加偏振片消除反光

漫反射光:磨砂玻璃濾光片

四、圖像處理:從二維到三維的躍升

景深擴(kuò)展技術(shù)

焦點(diǎn)堆疊法:拍攝15-20張不同焦面照片

軟件推薦:Helicon Focus(自動融合)

參數(shù)設(shè)置:重疊率70%+步進(jìn)1μm

三維合成

多角度拍攝:每30°拍攝一張(共12張)

軟件處理:Agisoft Metashape生成點(diǎn)云

輸出格式:OBJ/STL/PLY通用格式

五、特殊樣品處理技巧

液體樣品

密封艙法:使用透明比色皿

懸浮顆粒:添加甘油增加黏度

避免氣泡:真空泵脫氣處理

溫度敏感樣品

低溫臺:液氮冷卻至-196℃

加熱臺:PID溫控±0.5℃

相變觀察:緩慢升溫(0.5℃/min)

常見失敗案例警示

案例1:未固定昆蟲翅膀?qū)е掠^察時移動
改進(jìn)方案:昆蟲針+軟蠟固定

案例2:金屬部件反光嚴(yán)重
優(yōu)化策略:環(huán)形偏振光+消光漆處理

案例3:景深不足導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)模糊
解決方案:焦點(diǎn)堆疊+后期融合

結(jié)語:讓宏觀世界躍然屏上

體視顯微鏡的樣品制備是"微觀雕塑"與"光學(xué)魔術(shù)"的結(jié)合。建議建立標(biāo)準(zhǔn)化制備流程,記錄關(guān)鍵參數(shù)(如光源角度、固定方式)。

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